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| 植物源農藥研究進展綜述，為開發提供技術支撐 |
| 來源：《黑龍江農業科學》2021年第7期 2021-8-13 10:17:00 |
| 據研究，常用植物源農藥有生物堿類化合物、黃酮類化合物、萜類化合物、揮發油等，不同類型的化合物具有不同的骨架結構，根據化合物特性的的不同，選擇不同方式進行提取，不同的化合物也具有不同的抑菌及提高植物抗氧化力等生理特性。本文綜述了植物源農藥中常見活性成分的結構表征、提取方式及其抑菌研究進展，旨為植物源農藥的開發提供技術支撐…… 1、植物源農藥常用的活性提取物 1.1 生物堿類化合物 目前已發現的21,000多種生物堿類化合物，多分布在茄科植物的種、果、花、莖等植物部位。生物堿類化合物大多為環狀結構，氮素被包含在碳環內。在抑菌時C1、C2、C9和C10中的羥基作為取代基會出現結構取代的情況。生物堿常見類型有異喹啉類生物堿、喹啉類生物堿、吲哚類生物堿、哌啶類生物堿等，其中N-甲基四氫原小檗堿、原小檗堿和苯胺類生物堿的C2和C3的4階碳和亞甲二氧基在提高N-甲基四氫原小檗堿的抗病毒、抗菌和抗真菌活性方面起著重要作用。當進行生物堿類化合物的結構優化時，可重點優化生物堿的C2和C3的4階碳和亞甲二氧基，從而提高該類型化合物的抑菌效果。 1.2 黃酮類化合物 黃酮類化合物目前已發現800余種，屬于植物的次生代謝物質。黃酮類的化學結構類型較多，一般以C6-C3-C6的形式為基礎。黃酮類化合物是苯并-γ-pyrone衍生物，當病菌對其進行侵染時，它會根據其側組位置和換位進行分類；其藥理作用主要是根據它的結構類別、羥基化程度、其他取代和共軛以及聚合程度相互協同合作，其中類黃酮在生物系統中保護作用歸因于它們傳遞氫或電子自由基的能力；而芳香環上特殊位置的羥基能夠提高抑菌作用。在進行黃酮類化合物的結構優化時，可先尋找到該物質芳香環的羥基，調整其位置，再查看該羥基在新位置上與它的結構類別、其他取代和共軛以及聚合程度互相協作的效果，從而達到整體提高黃酮類化合物的抑菌效果。 1.3 萜類化合物 在天然產物中，萜類化合物是結構最多、結構最大的化合物之一，目前已發現50,000多種。萜類化合物可根據異戊二烯進行分類，即將不同碳數量及組成結構進行線性排列，形成多個異戊二烯單元組成的頭尾相連的異戊二烯聚合體，少部分萜類化合物也會以各種含氧衍生物的形式存在。萜類化合物主要由甲羥戊酸途徑生成，但也可能來源于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸，而缺少吡喃環時，則一般被認為沒有活性，不具備抑菌作用。在進行萜類化合物的結構優化時，可以吡喃環為切入點進行研究，來提高萜類化合物的抑菌效果。 1.4 揮發油 揮發油又稱植物精油，主要來自芳香植物，是脂溶性的天然化合物。植物精油成分復雜，按化學結構分為芳香族、脂肪族和萜類，其中以萜類成分為主，主要包括單帖、倍半萜以及醇類、酚類、醚類、醛、酮、羧酸和酯等含氧衍生物。揮發油的活性可能是由某些小化合物如香芹酮的存在所致。揮發油所含成分太多，可推測出抑菌作用主要源于它的組成成分的協同作用，并非一種物質的作用。進行結構優化太過復雜。 2、活性物質提取方式 植物會通過自身的代謝功能合成不同的化學物質以及衍生物，這些物質具有抑菌、抗病、抗氧化等作用。因此可以根據不同成分的特性選擇合適提取方式進行成分提取。 2.1 生物堿類化合物 在提取生物堿時，生物堿的溶解性能是提取方式選擇依據，因此根據不同生物堿在不同溶劑中的溶解度進行溶劑選擇，在進行親水性生物堿的提取時要注意溶劑酸堿度的調節。Wei等將白屈菜粉碎后超聲波提取，固液比為1∶8，提取液為75%乙醇，85%超聲頻率提取35 min得到白屈菜紅堿；白屈菜紅堿濃度為1.7×10-6mg/mL時，抑菌活性最高，對番茄枯萎病菌Z0413、黃瓜枯萎病菌Z0418等具有使用量少、抑菌性強的特點。Han等將延胡索粉碎后用正乙烷、乙酸乙酯、氯仿浸提分餾，純化后得到3種異喹啉生物堿脫氫木犀草堿、針刺堿和蟲草堿，3種堿對小麥葉銹病菌、花椒炭疽病菌均有一定的抑制作用，研究發現C-13和季銨鹽中甲基的缺失氮原子在抗真菌藥物中起著重要作用。陳偉等依次使用乙酸、氨水、正丁醇和甲醇對馬鈴薯薯芽與薯皮進行粉碎萃取，不斷調節溶劑酸堿度，最后得到馬鈴薯糖苷生物堿；隨著濃度增大，馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞致腐病原菌鐮孢菌的抑制作用隨之增強，但濃度不能高于0.15 g/mL。周兵等按照醇-酸水-有機溶劑提取（95%乙醇回流提取2 h后，依次用酸性水溶液和濃氨水進行酸堿處理，最后用氯仿萃取）法對碎米莎草莖進行總生物堿提取；隨著濃度的增加，總生物堿對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌和楊樹潰瘍病菌的抑制作用隨之增加，但對水稻苗高有嚴重抑制作用。 因此，在提取生物堿時，不光要根據溶劑極性來提取對應的生物堿類化合物，還要在提取過程中不斷調節溶劑的酸堿度。不同類型的生物堿對不同的植物病害有一定的抑制作用，總生物堿類化合物不能用于水稻田，會影響水稻幼苗的生長。 2.2 黃酮類化合物 黃酮類化合物提取的關鍵在于所提取的黃酮類物質是游離苷元還是苷類化合物，不同的化合物使用極性不同的溶劑，極性越大的溶劑所提取的極性化合物含量會越多，不同極性的溶劑混合提取會出現協同作用。Bartmańska等使用不同極性的溶劑分別從廢除的啤酒花殘渣中浸提得到7種黃酮類化合物，其中2種為天然黃酮（α，β-二羥基胡蘿卜素和8-丙基柚皮素），提取黃腐醇含量最多的溶劑是甲醇＋二氯甲烷；丙酮、乙酸乙酯、甲醇的粗提物對鐮刀菌的抑制所差無幾，而亞甲基氯化物則對灰霉病菌有較強的抑制作用。EL-Hefny等使用乙酸乙酯和甲醇分別對大黃的根部進行萃取，分餾分離后物質用蒸餾水配制成含有黃酮-3-醇和二苯乙烯的藥液，并對田間感染稻瘟菌的小麥進行抑菌試驗；結果顯示，其能顯著抑制病菌孢子的萌發。 2.3 萜類化合物 萜類化合物常用的提取方式為壓榨法、水蒸氣蒸餾法、脂浸潤法、超靈界流體萃取法和溶劑提取法。前4種方法可用于提取精油，一般萜類提取都是根據提取物質的苷元形式選擇不同極性、不同沸點的溶劑。Oludemi等將靈芝先進行乙醇回流提取，干燥后按照提取時間78.9 min、提取溫度90℃、溶劑62.5%乙醇進行熱萃取，得到提取率為（4.9±0.6）%，含量為（435.6±21.1）mg/g的三萜。Popov等研究發現，乙酸乙酯提取白樺醇的純度比95%乙醇提取的白樺醇純度高，并且可以在乙酸乙酯提取完白樺醇之后，使用水蒸餾法將提取殘渣中的乙酸乙酯回收，形成綠色萃取。Qun等通過使用蒸餾水，保證1∶55 （g/mL）的固液比，在超聲波-微波輻照功率90Ｗ，提取周期75 s的條件下對角果進行三萜類化合物提取，得到16.789 mg/g，與預期相符。 2.4 揮發油 揮發油最常見的成分就是單帖及倍半萜，因此提取精油時常用水蒸氣法和超臨界流體萃取法。Bammou等通過水精蒸餾裝置對蚤草屬進行水蒸氣蒸餾，提取精油對尖孢鐮刀菌有一定的抗性。Shukla等使用超臨界CO2對干姜進行多分離器在線分餾，CO2回收率為96.15%。工業生產中的工藝優化及其驗證標度單位表明，超臨界CO2萃取和同步萃取分餾可用于一系列天然生物活性化合物，如維生素、必需脂肪酸。Agha等采用二維氣相色譜法和簡易氣相色譜法對天竺葵提取揮發油的化學成分進行檢測，揮發油的主要成分是香茅醇、香葉醇和芳樟醇。揮發油也多用于果蔬保鮮及美妝行業中，所以使用超臨界CO2作為萃取劑，既價格低廉，又無殘留，且不破壞化合物結構。在提取各類化合物時，除了根據不同提取物質選擇不同極性的溶劑外，可以采用微波輔助提取或超聲波輔助提取方式。對比傳統的溶劑提取法，通過超聲或微波產生切向力，使溶劑滲入，加速有效成分進入提取溶劑中，從而提高提取率，且不降低提取物的活性。郭孝武分別使用超聲波輔助提取法、回流提取法、浸提法對益母草的總生物堿進行提取，發現超聲波輔助提取法的提取率較其他2種方法要高，且未改變提取物的化學結構。
3、活性物質抑菌機制 3.1 生物堿類化合物 生物堿類化合物可以在需要保護的細胞上形成一層保護膜，從而減少其他病菌對細胞的破壞。Zhao等使用異喹啉生物堿對稻瘟病菌進行抑制試驗，結果表明，菌絲體彎曲、崩解，細胞膜完整性受損，同時還抑制菌絲的活性氧生成，破壞了菌絲的膜功能和細胞增殖。 對于病菌抑制，生物堿類化合物可對病菌細胞基因及酶類進行影響，或者對細胞膜、菌絲生長形態造成影響，從而達到抗病的作用。 3.2 黃酮類化合物 黃酮類化合物的抗病性可能是非特異性的，通過黃酮類化合物的抗氧化性，使致病菌因缺氧而失去活性，影響生物膜的形成、膜的通透性等生理特性，影響某些酶對細胞質的抑制。Rachmawaty等對干燥的可可果進行粉碎后使用7∶3的丙酮水溶液浸提3次，得到黃酮類化合物，發現其對尖孢菌的孢子有強烈的抑制作用。Chen等研究發現黃芩素在32和64μg/mL時對病菌具有下調群體感應系統調節因子及基因細胞間粘附素在生物膜中的表達生產細胞的能力。 3.3 萜類化合物 萜類化合物對真菌的抑制作用主要表現在對真菌菌絲的生長抑制，使其尖端膨脹、分支形成孢子梗或使菌絲斷裂，對細胞造成破壞以及對真菌細胞蛋白的下調。楊婷等對13種萜類化合物進行抑菌篩選，其中，香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對孢炭疽菌的最佳抑制濃度為50μg/mL。Alexa等對丹參和百里香分別進行萃取，得到γ-松油烯和ｐ-百里香酚，兩者混合對禾谷鐮刀菌有一定的抑制協同作用。丁蘭等從香茶菜屬中分離出4種萜類物質（leukamein E、weisiensin B、熊果酸和2-α-羥基熊果酸），并考察幾種物質對蝴蝶蘭莖腐病中分離出的鐮孢屬真菌的抑制活性；發現真菌的菌絲簡短膨大成為囊泡，出現斷裂，逐漸變為空泡；菌絲體細胞膜結構被嚴重破壞，且大大改變了其通透性。
3.4 揮發油 揮發油是通過精油及其組分對細胞膜造成破壞，增大膜的通透性，致使細胞內的物質泄漏，或直接破壞病菌的酶系統，致其死亡。Moghaddam等發現從山羊草種子中提取的精油對青枯病菌有較強的抑制活性，能夠顯著抑制菌絲的生長。Yu等考察從茶樹中提取的精油對灰霉病菌的抑制活性，研究發現精油中的α-松油醇、1,8-桉葉素混合后能穿透病菌細胞，破壞細胞器而不影響細胞膜透性。相比之下，松油烯破壞了膜的完整性，增加了膜的通透性，導致離子滲漏和膜功能障礙。 4、展 望 目前研究人員對各類植物源化合物已有一定的研究，但不同類型化合物的生物功能和生態化學功能尚未被充分研究，例如化合物在植物體內代謝過程、所具有的功能，以及在生態環境中的存在形式與歸宿途徑等。 在提取工藝中，不僅要考慮優化工藝增加物質提取率或提取出其他物質類型，還要考慮提取成本，以及商業生產的經濟性，是否適用于工廠批量化生產。例如將許多高質量的有價值的化合物被一個單一的步驟回收，從某種低廉的植物中得到大量高質量的化合物等。對于植物源農藥，所需化合物的活性篩選仍然是新農藥開發的關鍵步驟，具有較高活性的化合物可以直接開發為新藥。化合物的結構對于抑菌活性有著重要影響，因此可以將“組學”技術與分子網絡藥理學相結合，在原物質結構的基礎上進行結構修飾，合成具有高效抑菌能力的新物質。 |
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