|
| 武夷菌素產品的創制與應用 |
| 來源：《中國生物防治學報》2021年第4期 2022-2-21 10:07:00 |
| 化學農藥在防治農作物病蟲害及保障糧食豐收方面發揮著重要的作用。但是，長期及過量使用化學農藥不僅會導致病原菌產生抗藥性，而且會造成農產品殘留超標、環境污染等問題。因此，加速推進安全、高效且選擇性強的生物農藥的研制和開發勢在必行。 武夷菌素是由中國農業科學院植物保護研究所研制的一種具有我國自主知識產權的新型生物農藥，具有低毒、高效、廣譜、環保等特點，主要用于防治農作物真菌病害，對白粉病、灰霉病和黑星病等效果顯著。武夷菌素先后獲得“國家重點新產品”證書（2000G041B326001）和有機產品認證（COFCC-R-0903-0070），被列入國家蔬菜病蟲害安全防治技術規范國家標準（NY/T5006—2001）和農業行業無公害蔬菜生產技術規程行業標準（NY/T5074—2002），成為我國無公害蔬菜和有機蔬菜生產中防治病害的重要生物殺菌劑產品之一，為綠色植保及農業可持續發展做出了一定的貢獻。
01、產品創制 1.1 產生菌及分類鑒定 武夷菌素（又稱BO-10），是1979年在福建省武夷山上采集的土壤樣品中依據微生物菌株代謝產物的抑菌活性、內吸性等標準篩選到的武夷菌素原始菌種，根據菌株的形態特征和生理生化特點，進行分類鑒定并命名為不吸水鏈霉菌武夷變種Streptomyces ahygroscopicusvar. wuyiensis。后期經過分子鑒定和全基因組測序比對將其更名為小白鏈霉菌武夷變種S. albulus var. wuyiensis。 1.2 理化性質及有效成分結構鑒定 武夷菌素粗制品經Sephadex-G-25柱層析、水洗脫等方法可制備成精制品，其中有兩種不同有效成分武夷菌素a和b，其中a成分的含量占86%左右，b成分的含量為13%左右。武夷菌素精制品經冷凍干燥后為微黃色的粉末，熔點為239℃，易吸濕、極易溶于水、微溶于甲醇、不溶于丙酮和氯仿等有機溶劑。主效成分a通過紅外光譜、碳譜、氫譜分析，確定該組分的分子式C13H21N3O14，是一種含有胞苷骨架和過氧鍵的核苷類抗生素，經專利局查新證明，該化合物是一種結構全新、具有自主知識產權的新型農用抗生素。此外，研究表明武夷菌素具有較強的抑菌活性，原因是其產生菌含有豐富的次生代謝產物，已分離鑒定出的活性組分還包含納他霉素、豐加霉素、谷氏菌素、制霉菌素、ε-聚賴氨酸、苯甲酸、間苯二甲酸和黃酮類化合物等。 1.3 作用機理 武夷菌素防治植物病原真菌的作用機制包括兩個方面，一方面武夷菌素直接抑制病原菌生長以及分生孢子萌發。武夷菌素可使病原真菌分生孢子的萌發速度和產孢量顯著下降，且菌絲生長變慢，分支增多、末端膨大、液泡數目增多；菌絲頂端出現原生質滲漏的現象，而芽管膨大、縊縮，影響真菌的亞細胞結構和細胞膜的滲透性；干擾菌絲體蛋白質、核酸及細胞壁幾丁質的正常合成，從而起到抑菌的作用。另一方面，武夷菌素通過啟動防御反應的相關信號途徑，提高植物體內防御相關酶（如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性，進而提高植物自身的抗病性。 1.4 毒性及安全性評價 武夷菌素的急性毒性試驗結果為LD50＞10 g/kg體質量，屬于相對無毒。蓄積毒性系數＞5，故無明顯蓄積性。武夷菌素對大鼠最大無作用劑量為5,000 mg/kg，無致畸、致突變效應。武夷菌素各項指標均符合國家衛生標準。 武夷菌素對環境生物的毒性和安全性評估結果為，蜜蜂LD50（48 h）＞5,000 mg/mL；家蠶LD50（2齡）＞3,226 mg/kg；斑馬魚LD50（96 h）＞89.92 mg/mL；鵪鶉LD50（7 d）＞100 mg/kg。根據國家農藥對環境生物的毒性及風險性分級標準，武夷菌素對蜂、蠶、鳥、魚均為低毒。 1.5 產品登記 通過極性溶劑與穩定劑篩選、多孔性載體吸附能力比較和助劑增效配伍等一系列技術措施，創制出1%水劑、2%水劑和3%可溶粉劑武夷菌素系列產品（農藥登記證號：LS981038、LS20083112）。其中1%水劑獲得農藥生產批準證書，在中國20多個省市（自治區）蔬菜、果樹等作物上應用，推廣應用超過200萬hm2。 02、高產菌株選育 2.1 傳統育種技術 開展選育遺傳性狀穩定的高產優良菌株是提高菌株單位效價，降低生產成本，提升武夷菌素產業化生產水平和提高產品競爭力的關鍵環節。前期，采用傳統的物理和化學誘變技術、原生質體融合等育種方法，獲得了一系列在武夷菌素產量上比原始菌株有大幅提升的高產菌株。利用60Co-γ-射線和中子照射的M35和M46突變體作為親本進行原生質體融合，選擇營養標記互補的穩定的原養型重組子，獲得高產菌株F31-24，效價比出發菌株提高了約80%。以L7為出發菌株，采用不同劑量（500 Gy、1,000 Gy和1,500 Gy）的60Co-γ-射線進行輻照誘變，成功選育遺傳穩定性良好的菌株C-75，其效價較出發菌株提高34.4%。采用低能碳離子注入的方法，獲得高產菌株F64（菌種保藏號CGMCC No.1967），效價可提高到6,643 ?g/mL，是出發菌株的2.5～3倍，發酵時間可縮短5～10 h。傳統育種雖能有效選育武夷菌素高產菌株，但存在隨機性大、費時費力、易回復突變甚至還可能引入不利突變，無法實現精準的定向選育。 2.2 分子育種技術 基因工程育種相比傳統育種具有專一性強、育種周期短、不易產生回復突變等優點，能夠有效彌補傳統育種的不足。近年來，已完成武夷菌素產生菌的全基因組測序，克隆武夷菌素生物合成基因簇，成功建立了高效遺傳轉化體系，解析武夷菌素生物合成途徑及其關鍵調控機制。研究表明，武夷菌素生物合成基因簇，包括22個結構基因和6個調控基因。其中，通過增加正調控基因wysR基因的表達量，可顯著提高武夷菌素產量，發酵效價達到7,215 ?g/mL，較出發菌株提高26.5%。由于微生物在次級代謝過程中往往受多個基因協調控制，單個基因的缺失可能會由其他基因在功能上進行互補，因此單基因的遺傳操作具有一定的局限性。通常菌株體內含有復雜的代謝系統，很多同類型基因簇對前體的利用是相同的，因此他們之間存在相互作用。武夷菌素產生菌中含有谷氏菌素、豐加霉素、制霉菌素、納他霉素等其他活性成分。通過強啟動子kasO*p強啟動cluster5谷氏菌素生物合成基因簇的轉運基因gouM，獲得的菌株發酵液中武夷菌素產量較原始菌株提高了34.1%。此外，通過敲除豐加霉素生物合成基因中影響武夷菌素產量的toyG和toyF基因，構建的toyF基因缺失突變株和toyG基因缺失突變株武夷菌素產量較野生菌株分別提高了23.06%和18.28%。 03、發酵及提取工藝 采用響應面法優化了菌株F64的培養基配方和發酵條件，利用菌株F64和優化的培養基配方進行液體深層發酵培養，將有機碳源、有機氮源、速效碳源、無機氮源、無機鹽以及水和菌株F64加入到發酵罐中，在28℃條件下進行二級發酵。培養條件為：一級發酵時間30～36 h，二級發酵時間48～56 h，接種量5%，罐壓0.10 MPa，通氣量1∶0.9，攪拌轉速180 r/min。采用高產菌株F64和優化的培養基配方發酵生產武夷菌素，節約發酵成本20%～30%。 武夷菌素濃縮提取通常采用傳統的薄膜蒸發法，但該方法會導致武夷菌素分解，收率僅為70%～80%。根據武夷菌素的結構特征（分子量443），設計發明了一種以人工生物膜為材料的“三膜組合”的濃縮提取方法，其原理是精濾膜和超濾膜分別去除分子量大于1,500和800的大分子化合物，納濾膜可截留分子量為150～800的化合物，去除水分、無機鹽等小分子物質。“三膜組合”法可在常溫下濃縮提取武夷菌素，收率高達95%，不破壞武夷菌素的活性，且降低能耗、工藝簡便，實現低碳生產。 04、田間推廣應用效果 武夷菌素對蔬菜、果樹、糧食和經濟作物真菌病害有很好的防效，如對白粉病、灰霉病、霜霉病、黑星病、枯萎病、流膠病、腐爛病等均有很高的防效，同時還具有一定的增產作用。 4.1 蔬菜病害的防治 武夷菌素對各種作物白粉病特別是黃瓜白粉病防效在90%以上，防效與化學農藥三唑酮和百菌清相當。利用武夷菌素防治番茄葉霉病的防效穩定，在85%左右，防效超過化學農藥腐霉利和異菌脲以及生物農藥春雷霉素和多抗霉素。此外，武夷菌素對番茄灰霉病也具有較好的防治效果，其防效在80%以上，好于化學農藥速克靈，且武夷菌素和多抗霉素配合使用防效更佳。 4.2 糧食作物病害的防治 利用武夷菌素防治大豆灰斑病防效可達到97.12%，同時，武夷菌素對大豆炭疽病、菌核病也具有良好的防效。在四川蒲江進行的田間試驗表明，武夷菌素對小麥白粉病的防效達到84.7%，略低于25%三唑酮90.7%的防效，且武夷菌素對小麥葉銹病也有一定防效。此外，武夷菌素在控制玉米紋枯病中具有重要的應用潛力，其對玉米紋枯病生長具有顯著的影響，菌落直徑減少75%以上，菌絲致病力下降99%。 4.3 經濟作物病害的防治 武夷菌素防治花卉病害，特別是月季花白粉病，效果理想，在黑龍江省大慶市和深圳的田間試驗中，防效在85%左右；防治蘆筍莖枯病效果明顯，防效在80%以上；對茶樹上的炭疽病、白星病、油菜菌核病、根腐病、白粉病等均有良好防效。利用武夷菌素防治西瓜枯萎病防效達69.0%～85.7%，同時對西瓜炭疽病防效也較好。利用1%武夷菌素水劑200倍浸種24 h＋500倍噴根2次處理，能夠有效地控制棉花黃萎病的發生，防治效果達到83.33%，顯著好于多菌靈。 4.4 果樹病害的防治 武夷菌素對柑橘流膠病、瘡痂病、潰瘍病防效可達90%～100%，同時對柑橘炭疽病、腳腐病、煤污病、樹脂病也有很好的防效。在老果園連續5年應用生物農藥武夷菌素防治蘋果腐爛病，其平均防效達86.2%，高出腐必治的防效34%。它還是很好的防腐保鮮劑，對蘋果、桃、梨、枇杷、葡萄、獼猴桃、龍眼、荔枝等水果上的真菌性病害均有很好的防效。利用2%武夷菌素水劑對新疆厚皮甜瓜白粉病進行田間防效試驗發現其防效達到60.17%。此外，武夷菌素對草莓白粉病、灰霉病、葡萄白粉病、霜霉病、白腐病等也有良好防效。 05、展望 經過多年的研究和產業化生產應用，武夷菌素已成為我國無公害蔬菜生產中防治真菌病害的重要生物農藥產品之一。隨著全社會食品安全和環境安全意識的增強，武夷菌素作為一種高效、廣譜的生物農藥，具有廣闊的發展前景。但在產業化生產過程中也存在許多問題，如需要重新辦理正式登記、不斷提高菌株效價、優化發酵工藝、研發更高效的提取工藝、創新武夷菌素產品新劑型及完善田間應用技術等。 今后研究工作將主要集中在以下幾個方面： （1）加快推進正式登記辦理 依據2017年修訂后的《農藥管理條例》相關要求，完善登記所需的毒理、殘留、代謝等技術報告，盡快完成正式登記，繼續為農業綠色生產做貢獻。 （2）提高菌株效價及優化發酵工藝 基于傳統育種，綜合利用基因工程和代謝工程技術，選育高產菌株，同時改進發酵工藝，實現各種發酵技術參數優化組合，從根本上降低武夷菌素的生產成本，促進產業化發展。 （3）研發高效活性成分的提取技術 基于活性成分的理化特性，通過選擇合適的柱材，組合高效分離制備、濃縮凍干技術等，并結合高效液相色譜，不斷提高有效成分的含量，為研制武夷菌素產品新劑型奠定基礎。 （4）創新武夷菌素產品的新劑型 武夷菌素產品多為水劑形式，存在運輸及儲藏不便的缺點；武夷菌素粉劑產品中含有一定的糖分，儲存過程中容易潮解結塊。因此，需要進一步開發可濕性粉劑、顆粒劑、生物種衣劑、微膠囊劑等，提高儲存時化學性質穩定性，降低加工和儲運成本，提高藥劑與作物黏附性，節約藥劑施用的人力成本等。 （5）建立武夷菌素的配套應用技術 針對不同作物和防治對象，開展包括最佳施藥時期、施藥濃度、施藥間隔期及與其他生物防治產品配套使用的綜合防控技術，解決單一生物農藥難以在作物生長栽培周期防控多種病蟲害的問題。 |
 |
 |
| 相關閱讀 |
| 年后除草劑走勢或將走俏 |
| Innatus™3G多肽平臺與行業第二大參與者簽署評估協議 |
| 農藥行業要主攻三大瓶頸 |
 |
| 首頁 | 快訊 | 產品庫 | 廠家庫 | 圖譜 | 種植技巧 |
